摘要

     2021年8月26日美國化學(xué)會（ACS)期刊NANO發(fā)表了國家納米中心聶廣軍、王海課題組與北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李慧課題組最新的研究成果。論文的題目是“Separable Microneedle Patch toProtect and Deliver DNA Nanovaccines Against COVID-19”。

    這是一篇將DNA新冠疫苗做成可溶解微針的最新研究成果，與當(dāng)前肆虐全球的新冠疫情緊密相關(guān)。青瀾生物作為可溶解微針技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的先行者，我們認(rèn)為這是一篇不可多得的高水平研究文獻，下面青瀾就和大家一起詳細解讀這篇文獻，并結(jié)合公司自己的微針疫苗研發(fā)實踐，一同認(rèn)識可溶解微針DNA疫苗技術(shù)。

一、DNA疫苗與可溶解微針技術(shù)相結(jié)合，取得了較好的免疫效果

    在2020年初我國國家科技部確定的五條疫苗技術(shù)路線中，基因疫苗代表最新的技術(shù)路線。在新冠疫情來臨之前，全球尚無一款人用的基因疫苗上市，基因疫苗的新穎性可見一斑?；蛞呙缬址譃閙RNA疫苗和DNA疫苗，2020年12月21日輝瑞/BioNtech的mRNA新冠疫苗在歐盟有條件獲批上市，這是歷史上首個上市用于人體的mRNA疫苗。 DNA疫苗是將抗原蛋白編碼的DNA片段通過生物工程大量表達出來，做成具備各種功能段的環(huán)狀DNA質(zhì)粒。DNA質(zhì)粒被遞送進入細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄為RNA，再由后者翻譯成抗原蛋白?；蛞呙缦喈?dāng)于把抗原的生產(chǎn)過程從醫(yī)藥車間搬到細胞內(nèi)，基因疫苗能夠同時激起機體的體液免疫和細胞免疫。美國NASDAQ上市公司Inovio Pharmaceuticals, Inc.和港股準(zhǔn)上市公司蘇州艾棣維欣是全球DNA疫苗研發(fā)的佼佼者，目前兩家合作的DNA新冠疫苗正在全球9個國家開展三期臨床試驗。

   2021年8月20日，印度藥物監(jiān)管機構(gòu)批準(zhǔn)使用DNA新冠肺炎疫苗ZyCoV-D，在近日的臨床試驗中，該款三劑式的疫苗有效率達66%，成為印度第二種獲得批準(zhǔn)的國產(chǎn)疫苗。這也是世界上第一種新冠病毒DNA疫苗。有科技媒體調(diào)研發(fā)現(xiàn)，印度獲批的DNA疫苗在序列設(shè)計上與艾棣維欣/INOVIO已經(jīng)發(fā)表的臨床前研究披露的序列設(shè)計高度一致，但是考慮到印度疫情的嚴(yán)重程度，目前未有看到任何一方有相應(yīng)的知識產(chǎn)權(quán)方面的訴求。

聶廣軍課題組等將最新的DNA疫苗與概念性十足的可溶解微針技術(shù)結(jié)合，在體外試驗和動物試驗中都取得了較好的免疫效果。如果可以產(chǎn)業(yè)化，將真正地實現(xiàn)“不打針不吃藥”即完成疫苗的接種，突破現(xiàn)有技術(shù)，實現(xiàn)新的突破。

（圖1）

      如圖1所示，研究者設(shè)計的微針貼由三部分構(gòu)成，分別是載有DNA質(zhì)粒的針體部分，由溫敏材料組成的藍色中間分離層以及用于承載微針的灰色基膜層。當(dāng)載有疫苗的微針貼在皮膚上以后，降低溫度，藍色的分離層會逐漸液化（在14攝氏度左右，藍色中間分離層會液化從而使針體斷裂并留在皮膚內(nèi)），揭掉基膜，即可實現(xiàn)疫苗的接種，設(shè)計概念非常巧妙。由于表皮層是抗原呈遞細胞（APC，圖1中DC即是APC的一種)最豐富的部位，因此也是最好的免疫部位，比肌肉注射更少的疫苗劑量即可實現(xiàn)同等的免疫應(yīng)答。

  二、微針DNA新冠疫苗貼的邏輯和技術(shù)難度

      根據(jù)DNA疫苗的起效原理，只有將DNA疫苗遞送進入細胞核才可以發(fā)揮作用。如何將DNA疫苗成功遞送到細胞核內(nèi)，是該類疫苗成功研發(fā)的關(guān)鍵。微針刺破角質(zhì)層，將DNA疫苗成功遞送到皮膚的組織液，接下來還需要透過細胞膜，完成細胞質(zhì)中的溶酶體逃逸，穿過細胞核膜才可以到達細胞核。由于機制復(fù)雜，基因藥物的遞送在高校的藥劑學(xué)教材中，都是作為難度較大藥物劑型放在最后介紹。

     此外，聶廣軍課題組還將R848作為DNA疫苗的佐劑，與DNA疫苗進行同步遞送。由于R848這個佐劑不溶于水，要想成功完成DNA疫苗的遞送并發(fā)生效力，需要解決的技術(shù)難點多且大。

(圖2）

      為了完成上述目標(biāo)，聶廣軍課題組等巧妙的進行了藥物載體設(shè)計，如圖2所示，采用了PEI納米顆粒，PEI是陽離子聚合物，表面帶有大量正電荷，內(nèi)部疏水基團剛好用于包裹油溶性的R848佐劑。

     PEI納米顆粒外面可以吸附帶負(fù)電的DNA質(zhì)粒。PEI納米顆粒攜帶了DNA質(zhì)粒和佐劑，能夠完成透過細胞膜，良好的溶酶體逃逸能力，能最終將DNA質(zhì)粒和佐劑成功遞送進入細胞核內(nèi)。圖2方法制得的DNA納米粒子溶液與PVA材料組成了圖1所示的針體部分，在皮膚上貼敷后，針體部分溶斷在皮膚內(nèi)。包含DNA質(zhì)粒的納米顆粒經(jīng)過細胞的內(nèi)吞作用，被APC捕獲，研究者通過一系列的染色試驗，證明了納米顆粒被細胞成功內(nèi)吞、轉(zhuǎn)染以及抗原S和N蛋白的表達。作者甚至通過分離提純，在WESTERN POINT里宏觀看到了所表達的S和N蛋白。整個試驗設(shè)計邏輯嚴(yán)謹(jǐn)，試驗結(jié)果充分，間接和直接的證據(jù)都表明，微針DNA新冠疫苗貼能夠在體內(nèi)成功的實現(xiàn)了免疫。

     接下來，我們再通過圖3觀察一下微針疫苗貼的貼敷過程和貼前貼后微針貼的完整顯微照片。

（圖3）

    我們可以看到，貼敷后的殘貼上可以清晰的看到針體斷裂后留下的空位。當(dāng)把載有DNA質(zhì)粒的針尖液進行紅色染料標(biāo)記時，通過俯視圖和平視圖，可以清晰的看到針體部分完整無缺失。

    微針和性質(zhì)穩(wěn)定的DNA疫苗技術(shù)結(jié)合，做成DNA疫苗微針貼，不需要注射器，徒手就可以貼敷，貼敷過程猶如使用創(chuàng)可貼，而且患者無痛感，極大地提升了患者在接種疫苗的依從性。

    為了驗證常溫下DNA疫苗微針貼的穩(wěn)定性，研究者做了在室溫下的儲存試驗。結(jié)果表明，室溫放置幾個月的DNA疫苗微針貼，依然能夠具有充足的免疫原性。也就是說，DNA疫苗微針貼不需要冷鏈保存和運輸——這對于發(fā)展水平低下的國家和地區(qū)具有非常重要的現(xiàn)實意義，極大的提升了疫苗在這些地區(qū)的可及性。這不僅僅是核酸疫苗開發(fā)重大進展，也是整個疫苗領(lǐng)域重大的技術(shù)性突破。

     此外，作為平行試驗組，研究者還做了沒有PEI納米粒子包裹的裸DNA質(zhì)粒的微針貼，結(jié)果沒有觀察到細胞轉(zhuǎn)染，也沒有得到最終的S和N抗原蛋白的表達。研究者認(rèn)為這體現(xiàn)了PEI納米顆粒體系對于DNA質(zhì)粒遞送的重要性和必要性。

    文章有提到PEI雖然廣泛的被用于基因藥物的遞送，但是它的細胞毒性是潛在應(yīng)用存在的一個嚴(yán)肅問題。研究者認(rèn)為降低PEI的分子量會降低它的毒性，但是并不能完全消除它的細胞毒性。青瀾生物注意到在由潘衛(wèi)三教授主編的全國高等教育藥學(xué)類規(guī)劃教材《藥劑學(xué)》的基因藥物遞送章節(jié)中，也提到了非病毒載體的PEI材料，PEI包裹的DNA質(zhì)粒具有良好的透過細胞膜和溶酶體逃逸能力。PEI被廣泛地用于研究型的細胞轉(zhuǎn)染實驗，但是目前尚無含有PEI材料的藥物產(chǎn)品得到監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。

    青瀾生物于2021年2月開始與蘇州艾棣維欣合作進行DNA新冠微針貼疫苗的開發(fā)，雙方的目標(biāo)是該技術(shù)成功的產(chǎn)業(yè)化，將產(chǎn)品最終推向市場。

微針概念的提出有幾十年了，可溶解微針技術(shù)的提出也有近20年的歷史，我們經(jīng)常說微針技術(shù)是平臺技術(shù)，可以廣泛的用于藥物的遞送。然而，當(dāng)我們具體開展某款藥物的微針劑型時，依然是“從0到1”的過程，需要解決的技術(shù)問題非常多，難度也非常大。這也是為什么微針技術(shù)的發(fā)展前景被非?？春?、但至今卻仍未在藥物遞送領(lǐng)域真正走向商品化的原因。

    綜上我們所解讀的文獻研究內(nèi)容，我們了解到上述研究遞送的目標(biāo)藥物與青瀾生物所遞送的目標(biāo)藥物完全一致，這體現(xiàn)了青瀾生物在DNA微針疫苗研究領(lǐng)域的前沿性，同時對我們的產(chǎn)業(yè)化研究也有深度的啟發(fā)?！禢ANO》是ACS的知名期刊，影響因子（IF）超過17，是國際頂級期刊。在《NANO》上剛剛發(fā)表的這項前瞻性研究屬于基礎(chǔ)研究，橫跨了DNA疫苗和可溶解微針兩大前沿技術(shù)，但是要想實現(xiàn)這項技術(shù)的商業(yè)化往往是論文發(fā)表后若干年的事情。這還不是困難的全部，疫苗的研發(fā)和推向市場在解決技術(shù)問題的同時，還要滿足監(jiān)管部門的法規(guī)要求。

   不過好在微針技術(shù)是一個結(jié)果導(dǎo)向的技術(shù)，不管過程有多復(fù)雜難度有多大，它的終極目的是為了實現(xiàn)藥物遞送，讓藥物發(fā)揮作用。不過，在做這個技術(shù)研發(fā)的過程中，還要同步滿足藥監(jiān)部門的法規(guī)要求。青瀾生物和艾棣維欣都是商業(yè)化的企業(yè)，無論面對的項目有多難，雙方在決策啟動項目之前，目標(biāo)非常明確，就是盡快實現(xiàn)微針?biāo)幬镞f送的產(chǎn)業(yè)化。

三、青瀾關(guān)于微針疫苗的4點思考

    由于青瀾生物和艾棣維欣的相關(guān)研究尚未發(fā)表，因此很多數(shù)據(jù)和結(jié)果尚不能在此公開。青瀾的微針研發(fā)部分我們只能以點帶面，把一些研究結(jié)果與大家分享，過程涉及技術(shù)秘密，暫時不深入討論。

     在此我們僅就四個問題點進行討論，但是并不意味著我們需要解決的問題只有這四個方面。

     一、接種時間

     眾所周知，常規(guī)注射疫苗在接種后，需要在留置點觀察30分鐘，如有意外情況便于醫(yī)務(wù)人員及時處置。將疫苗接種方式改為可溶解微針貼以后，如果我們要求接種者留置數(shù)個小時，那肯定不能被患者接受，集中接種點也無法容納那么多的接種者。因此，我們必須把接種時間和留置觀察的總時間作為微針疫苗的研發(fā)輸入條件。

     接種時間要與傳統(tǒng)肌注相當(dāng)，再留置觀察30分鐘。為此聶廣軍課題組的文章中將微針貼設(shè)計成了三層結(jié)構(gòu)，中間的分離層能很快地液化從而讓針體部分實現(xiàn)快速斷裂。但是研究者選用的快速分離材料要求的溫度是14-16攝氏度（詳細見論文相應(yīng)部分），這個要求在疫苗接種實踐中顯然難以實現(xiàn)，這個設(shè)計也導(dǎo)致微針成品的質(zhì)量容易受到溫度的影響。從實驗室研究的角度來看，采用這樣的技術(shù)方案無可厚非，能達到最終的研究目的即可。但如果最終目的是需要上市申報的微針疫苗貼，必須采用可靠的工藝和合法合規(guī)的材料來實現(xiàn)，使用任何不被藥典收錄的材料，都將會給藥品申報帶來巨大的法規(guī)方面的困難。

     青瀾生物采用專利技術(shù)，完全使用藥典內(nèi)材料，只需幾秒的貼敷時間，即可實現(xiàn)微針?biāo)幬镌谄?nèi)快速釋放，幾乎是貼上即可移除。具體參見視頻展示。我們能夠看到貼敷之前顯微鏡可見染色針體整齊排列無缺損，貼敷好以后立即揭掉，我們看到揭下來的殘貼上染色針尖都不見了（此處我們以同樣具有角質(zhì)層的樹葉來代替皮膚）。在顯微鏡下觀察樹葉表面，發(fā)現(xiàn)每個刺入孔內(nèi)都有染色的藥物。

二、工藝問題

     從圖3可以看到，聶廣軍課題組團隊開發(fā)的微針由三層材料構(gòu)成，這也就意味著微針的生產(chǎn)過程會使用三種溶液進行制膜，所使用的材料是否滿足法規(guī)要求不談，這樣的工藝會導(dǎo)致生產(chǎn)效率較為低下，藥品質(zhì)量控制難度大，生產(chǎn)過程中和后續(xù)物流存儲過程藥品質(zhì)量風(fēng)險大。 從視頻可以清晰的看到，青瀾生物的微針由兩層構(gòu)成，分別是染色的針體部分以及無色的基膜部分。青瀾的第一個優(yōu)勢，是能做到在室溫下，貼敷幾秒即可實現(xiàn)藥物針尖的向皮內(nèi)遞送。第二個優(yōu)勢在于，青瀾微針產(chǎn)品的生產(chǎn)過程只有兩種溶液，分別是針尖液和基膜液，制膜過程只需要兩步。更難能可貴的是，視頻中的樣品并非實驗室制作，而是由青瀾生物的生產(chǎn)線制作完成。青瀾生物一貫堅持，在嘗試某個新工藝前就充分考慮到后續(xù)的可量化生產(chǎn)性，即研發(fā)的產(chǎn)品最終是否能在生產(chǎn)線實現(xiàn)穩(wěn)定、高效的生產(chǎn)。

       我們知道可溶解微針又包含兩種生產(chǎn)工藝，分別是一體針工藝（圖6）和分層針工藝（圖7），前者適用于化藥，后者適用于生物藥。

              （圖6）

（圖7）

        聶廣軍課題組的研究即采用了分層針工藝。在全球微針產(chǎn)業(yè)化領(lǐng)域，能成功大規(guī)模量產(chǎn)一體針工藝的公司可謂寥寥，青瀾生物已經(jīng)成功具備了分層針的大規(guī)模量產(chǎn)能力。2021年9月23日，艾棣維欣董事長兼首席科學(xué)家王賓教授帶領(lǐng)CMC團隊考察青瀾生物生產(chǎn)線（圖8），就工藝的可靠性和產(chǎn)能情況進行了現(xiàn)場考察和確認(rèn)。我們認(rèn)為，產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝一定要可靠，產(chǎn)能一定要跟上，否則研究做得再漂亮，如果最終不能實現(xiàn)穩(wěn)定量產(chǎn)，那也只有學(xué)術(shù)價值而無商業(yè)價值。

（圖8）

     鑒于與青瀾生物展開合作的藥企越來越多，2021年10月，青瀾生物在深圳銀星科技園投資建設(shè)了專門用于微針?biāo)幬镅邪l(fā)的GMP工廠，計劃2021年12月31日之前投入使用。

     在產(chǎn)業(yè)化階段，在實驗室探索微針的工藝已經(jīng)變得沒有太多價值，因為即使做出結(jié)果，無法固化工藝條件，也無法具體知道實驗結(jié)果是在什么樣的條件下做出。青瀾生物深圳茜坑工廠不再參與藥物研發(fā)，專注生產(chǎn)化妝品等醫(yī)美類微針產(chǎn)品，從物理硬件上實現(xiàn)化妝品和藥物研發(fā)生產(chǎn)分離。以DNA新冠疫苗產(chǎn)能為例，如果有需求，青瀾生物只需要3000平方的廠房，就可以生產(chǎn)出足夠全球人民接種的疫苗微針貼。

三、法規(guī)問題

       文獻研究中使用了PEI納米顆粒包裹的DNA質(zhì)粒和非水溶性佐劑，成功地解決了透膜、溶酶體逃逸等的問題，PEI材料也是科學(xué)研究中基因藥物遞送常用的轉(zhuǎn)染劑。然而，目前尚無一款使用PEI作為輔料的藥物產(chǎn)品獲得監(jiān)管部門的批準(zhǔn)——PEI的細胞毒性是不可回避的現(xiàn)實風(fēng)險。但在聶廣軍課題組的研究中，也得到了非常明確的結(jié)論：無PEI納米顆粒包裹的裸DNA質(zhì)粒即使做成了微針，也沒有成功實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染，也沒有檢測到有最終的抗原蛋白的表達，也就是說把裸DNA質(zhì)粒做成微針貼進行貼敷，是沒有免疫源性的，不能激起機體的免疫應(yīng)答。

      作為一個產(chǎn)業(yè)化企業(yè)，青瀾需要做可商業(yè)化的產(chǎn)品。在面臨法規(guī)監(jiān)管方面的難題和技術(shù)難題時，我們選擇了攻克技術(shù)難題，而不是挑戰(zhàn)監(jiān)管。使用一個不滿足監(jiān)管要求的材料，可能會導(dǎo)致我們的藥物開發(fā)在數(shù)年內(nèi)原地踏步。

      艾棣維欣與NASDAQ上市公司INOVIO采用電轉(zhuǎn)儀作為DNA疫苗克服透膜和溶酶體逃逸的工具，并且商品化了CELLECTRA電轉(zhuǎn)儀，采用電脈沖的物理方式讓DNA質(zhì)粒進入細胞核。有了電轉(zhuǎn)儀，青瀾生物在與艾棣維欣合作開發(fā)過程中，始終堅持遞送裸質(zhì)粒，不引入不符合法規(guī)的任何材料，并在動物實驗中獲得了較好的抗體滴度。

四、實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定性

    可溶解微針是一種藥物遞送方式，是一種劑型技術(shù)。2017年，F(xiàn)DA出了非強制性的微針類產(chǎn)品審評指南，并在2020年做了更新，將可溶解微針技術(shù)在審評原則上歸為藥械組合，雖然我們堅持認(rèn)為可溶解微針本質(zhì)上是創(chuàng)新劑型，但是對微針這樣顛覆性的技術(shù)，F(xiàn)DA出一個審評原則總比審評方式空缺要好，至少讓可溶解微針的研發(fā)和申報有了一個指導(dǎo)原則。歐洲、日本、中國的藥監(jiān)部門應(yīng)該都會參考這個審評指導(dǎo)原則。

      可溶解微針既然是一種劑型，是藥物的承載和遞送方式，那么可溶解微針產(chǎn)品的相關(guān)研究數(shù)據(jù)也應(yīng)該是與藥品劑型研發(fā)有同等的要求。但目前行業(yè)大多企業(yè)關(guān)于可溶解微針的可靠性數(shù)據(jù)研究數(shù)據(jù)不夠穩(wěn)定。部分藥企的某款藥物采用了微針劑型，所得到的研發(fā)數(shù)據(jù)雜亂無章，不要說拿去申報，可能自己內(nèi)部都無法整理成確定的實驗結(jié)果。青瀾生物接觸過的某歐洲藥企，溝通完后認(rèn)為青瀾生物在微針方面確實談了一些之前未掌握的技術(shù)信息，但是不愿意再次啟動微針項目，原因是其與美國某微針企業(yè)之前開展過一次微針?biāo)幬锏难邪l(fā)合作，但是得到的研發(fā)數(shù)據(jù)很不穩(wěn)定，不能作為研發(fā)結(jié)果沉淀下來，最后不得不終止項目。

     微針?biāo)幬镅邪l(fā)的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性平行性，是阻礙微針行業(yè)產(chǎn)業(yè)化的重要因素，如果研發(fā)數(shù)據(jù)雜亂無章，那就說明這個微針技術(shù)不是穩(wěn)定可靠的遞送方式，這是藥物這種特殊商品所不能接受的。

      我們反復(fù)強調(diào)可溶解微針技術(shù)是一個結(jié)果導(dǎo)向的技術(shù)，微針?biāo)幬镅邪l(fā)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性也只能靠多批次的實驗結(jié)果來證明，而不能通過其他間接方式證明。

     在我們與艾棣維欣合作研究的9個月中，青瀾生物負(fù)責(zé)微針制劑學(xué)開發(fā)、微針生產(chǎn)工藝開發(fā)、微針質(zhì)量研究等方面的工作，評價方面的所有工作由艾棣維欣完成，青瀾生物協(xié)助貼敷方法培訓(xùn)。

     在青瀾向艾棣維欣提供的若干批次的樣品，不論每個批次的抗體滴度的絕對值高低，在批次內(nèi)數(shù)據(jù)平行性都非常好，不論結(jié)果好壞，都非常好下清晰的結(jié)論。當(dāng)收到艾棣維欣方面的結(jié)果反饋，青瀾生物在調(diào)整優(yōu)化變量時，所得到的結(jié)果與所調(diào)整的變量剛性相關(guān)，研究邏輯隨著研究的進展越發(fā)牢固。研究一路走來，逢山開路，逢水搭橋，有一些需要研究的基礎(chǔ)問題，整個文獻領(lǐng)域內(nèi)都尚無人展開研究，我們都要去研究并找到相應(yīng)的產(chǎn)業(yè)化解決之道。

       困難道路需要結(jié)伴同行。在與艾棣維欣合作2個月時，2021年4月雙方洽談?wù)归_戰(zhàn)略合作，由艾棣維欣戰(zhàn)略入股青瀾生物，并于3個月后完成交割。這是雙方在技術(shù)、公司文化兩方面的深度互信的結(jié)果。

        基因藥物遞送幾乎是所有藥物遞送里最難的，也是最麻煩的。青瀾生物有幸在啟動的第一個藥物項目就是DNA新冠疫苗，在與艾棣維欣合作的9個月里，我們深入的與艾棣維欣的研發(fā)、質(zhì)量、法規(guī)注冊、CMC等各部門進行了多輪溝通，讓我們深刻的學(xué)習(xí)了滿足法規(guī)下的技術(shù)研發(fā)如何開展。

         今年是青瀾生物的藥物研發(fā)年，下半年陸續(xù)有數(shù)家國內(nèi)上市藥企與青瀾生物展開合作。目前青瀾生物涉及的微針?biāo)幬锖wDNA疫苗、滅活疫苗、蛋白、多肽、水溶性化藥、非水溶性化藥等，我們的實驗室冰箱里，存放了很多藥企客戶郵寄過來的各種原料藥。路漫漫其修遠兮，吾將上下而求索。青瀾生物的使命就是實現(xiàn)可溶解微針技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化。