摘要

     2021年8月26日美國化學會（ACS)期刊NANO發(fā)表了國家納米中心聶廣軍、王海課題組與北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院李慧課題組最新的研究成果。論文的題目是“Separable Microneedle Patch toProtect and Deliver DNA Nanovaccines Against COVID-19”。

    這是一篇將DNA新冠疫苗做成可溶解微針的最新研究成果，與當前肆虐全球的新冠疫情緊密相關。青瀾生物作為可溶解微針技術產業(yè)化的先行者，我們認為這是一篇不可多得的高水平研究文獻，下面青瀾就和大家一起詳細解讀這篇文獻，并結合公司自己的微針疫苗研發(fā)實踐，一同認識可溶解微針DNA疫苗技術。

一、DNA疫苗與可溶解微針技術相結合，取得了較好的免疫效果

    在2020年初我國國家科技部確定的五條疫苗技術路線中，基因疫苗代表最新的技術路線。在新冠疫情來臨之前，全球尚無一款人用的基因疫苗上市，基因疫苗的新穎性可見一斑。基因疫苗又分為mRNA疫苗和DNA疫苗，2020年12月21日輝瑞/BioNtech的mRNA新冠疫苗在歐盟有條件獲批上市，這是歷史上首個上市用于人體的mRNA疫苗。 DNA疫苗是將抗原蛋白編碼的DNA片段通過生物工程大量表達出來，做成具備各種功能段的環(huán)狀DNA質粒。DNA質粒被遞送進入細胞核內轉錄為RNA，再由后者翻譯成抗原蛋白?；蛞呙缦喈斢诎芽乖纳a過程從醫(yī)藥車間搬到細胞內，基因疫苗能夠同時激起機體的體液免疫和細胞免疫。美國NASDAQ上市公司Inovio Pharmaceuticals, Inc.和港股準上市公司蘇州艾棣維欣是全球DNA疫苗研發(fā)的佼佼者，目前兩家合作的DNA新冠疫苗正在全球9個國家開展三期臨床試驗。

   2021年8月20日，印度藥物監(jiān)管機構批準使用DNA新冠肺炎疫苗ZyCoV-D，在近日的臨床試驗中，該款三劑式的疫苗有效率達66%，成為印度第二種獲得批準的國產疫苗。這也是世界上第一種新冠病毒DNA疫苗。有科技媒體調研發(fā)現(xiàn)，印度獲批的DNA疫苗在序列設計上與艾棣維欣/INOVIO已經發(fā)表的臨床前研究披露的序列設計高度一致，但是考慮到印度疫情的嚴重程度，目前未有看到任何一方有相應的知識產權方面的訴求。

聶廣軍課題組等將最新的DNA疫苗與概念性十足的可溶解微針技術結合，在體外試驗和動物試驗中都取得了較好的免疫效果。如果可以產業(yè)化，將真正地實現(xiàn)“不打針不吃藥”即完成疫苗的接種，突破現(xiàn)有技術，實現(xiàn)新的突破。

（圖1）

      如圖1所示，研究者設計的微針貼由三部分構成，分別是載有DNA質粒的針體部分，由溫敏材料組成的藍色中間分離層以及用于承載微針的灰色基膜層。當載有疫苗的微針貼在皮膚上以后，降低溫度，藍色的分離層會逐漸液化（在14攝氏度左右，藍色中間分離層會液化從而使針體斷裂并留在皮膚內），揭掉基膜，即可實現(xiàn)疫苗的接種，設計概念非常巧妙。由于表皮層是抗原呈遞細胞（APC，圖1中DC即是APC的一種)最豐富的部位，因此也是最好的免疫部位，比肌肉注射更少的疫苗劑量即可實現(xiàn)同等的免疫應答。

  二、微針DNA新冠疫苗貼的邏輯和技術難度

      根據(jù)DNA疫苗的起效原理，只有將DNA疫苗遞送進入細胞核才可以發(fā)揮作用。如何將DNA疫苗成功遞送到細胞核內，是該類疫苗成功研發(fā)的關鍵。微針刺破角質層，將DNA疫苗成功遞送到皮膚的組織液，接下來還需要透過細胞膜，完成細胞質中的溶酶體逃逸，穿過細胞核膜才可以到達細胞核。由于機制復雜，基因藥物的遞送在高校的藥劑學教材中，都是作為難度較大藥物劑型放在最后介紹。

     此外，聶廣軍課題組還將R848作為DNA疫苗的佐劑，與DNA疫苗進行同步遞送。由于R848這個佐劑不溶于水，要想成功完成DNA疫苗的遞送并發(fā)生效力，需要解決的技術難點多且大。

(圖2）

      為了完成上述目標，聶廣軍課題組等巧妙的進行了藥物載體設計，如圖2所示，采用了PEI納米顆粒，PEI是陽離子聚合物，表面帶有大量正電荷，內部疏水基團剛好用于包裹油溶性的R848佐劑。

     PEI納米顆粒外面可以吸附帶負電的DNA質粒。PEI納米顆粒攜帶了DNA質粒和佐劑，能夠完成透過細胞膜，良好的溶酶體逃逸能力，能最終將DNA質粒和佐劑成功遞送進入細胞核內。圖2方法制得的DNA納米粒子溶液與PVA材料組成了圖1所示的針體部分，在皮膚上貼敷后，針體部分溶斷在皮膚內。包含DNA質粒的納米顆粒經過細胞的內吞作用，被APC捕獲，研究者通過一系列的染色試驗，證明了納米顆粒被細胞成功內吞、轉染以及抗原S和N蛋白的表達。作者甚至通過分離提純，在WESTERN POINT里宏觀看到了所表達的S和N蛋白。整個試驗設計邏輯嚴謹，試驗結果充分，間接和直接的證據(jù)都表明，微針DNA新冠疫苗貼能夠在體內成功的實現(xiàn)了免疫。

     接下來，我們再通過圖3觀察一下微針疫苗貼的貼敷過程和貼前貼后微針貼的完整顯微照片。

（圖3）

    我們可以看到，貼敷后的殘貼上可以清晰的看到針體斷裂后留下的空位。當把載有DNA質粒的針尖液進行紅色染料標記時，通過俯視圖和平視圖，可以清晰的看到針體部分完整無缺失。

    微針和性質穩(wěn)定的DNA疫苗技術結合，做成DNA疫苗微針貼，不需要注射器，徒手就可以貼敷，貼敷過程猶如使用創(chuàng)可貼，而且患者無痛感，極大地提升了患者在接種疫苗的依從性。

    為了驗證常溫下DNA疫苗微針貼的穩(wěn)定性，研究者做了在室溫下的儲存試驗。結果表明，室溫放置幾個月的DNA疫苗微針貼，依然能夠具有充足的免疫原性。也就是說，DNA疫苗微針貼不需要冷鏈保存和運輸——這對于發(fā)展水平低下的國家和地區(qū)具有非常重要的現(xiàn)實意義，極大的提升了疫苗在這些地區(qū)的可及性。這不僅僅是核酸疫苗開發(fā)重大進展，也是整個疫苗領域重大的技術性突破。

     此外，作為平行試驗組，研究者還做了沒有PEI納米粒子包裹的裸DNA質粒的微針貼，結果沒有觀察到細胞轉染，也沒有得到最終的S和N抗原蛋白的表達。研究者認為這體現(xiàn)了PEI納米顆粒體系對于DNA質粒遞送的重要性和必要性。

    文章有提到PEI雖然廣泛的被用于基因藥物的遞送，但是它的細胞毒性是潛在應用存在的一個嚴肅問題。研究者認為降低PEI的分子量會降低它的毒性，但是并不能完全消除它的細胞毒性。青瀾生物注意到在由潘衛(wèi)三教授主編的全國高等教育藥學類規(guī)劃教材《藥劑學》的基因藥物遞送章節(jié)中，也提到了非病毒載體的PEI材料，PEI包裹的DNA質粒具有良好的透過細胞膜和溶酶體逃逸能力。PEI被廣泛地用于研究型的細胞轉染實驗，但是目前尚無含有PEI材料的藥物產品得到監(jiān)管部門的批準。

    青瀾生物于2021年2月開始與蘇州艾棣維欣合作進行DNA新冠微針貼疫苗的開發(fā)，雙方的目標是該技術成功的產業(yè)化，將產品最終推向市場。

微針概念的提出有幾十年了，可溶解微針技術的提出也有近20年的歷史，我們經常說微針技術是平臺技術，可以廣泛的用于藥物的遞送。然而，當我們具體開展某款藥物的微針劑型時，依然是“從0到1”的過程，需要解決的技術問題非常多，難度也非常大。這也是為什么微針技術的發(fā)展前景被非?？春?、但至今卻仍未在藥物遞送領域真正走向商品化的原因。

    綜上我們所解讀的文獻研究內容，我們了解到上述研究遞送的目標藥物與青瀾生物所遞送的目標藥物完全一致，這體現(xiàn)了青瀾生物在DNA微針疫苗研究領域的前沿性，同時對我們的產業(yè)化研究也有深度的啟發(fā)。《NANO》是ACS的知名期刊，影響因子（IF）超過17，是國際頂級期刊。在《NANO》上剛剛發(fā)表的這項前瞻性研究屬于基礎研究，橫跨了DNA疫苗和可溶解微針兩大前沿技術，但是要想實現(xiàn)這項技術的商業(yè)化往往是論文發(fā)表后若干年的事情。這還不是困難的全部，疫苗的研發(fā)和推向市場在解決技術問題的同時，還要滿足監(jiān)管部門的法規(guī)要求。

   不過好在微針技術是一個結果導向的技術，不管過程有多復雜難度有多大，它的終極目的是為了實現(xiàn)藥物遞送，讓藥物發(fā)揮作用。不過，在做這個技術研發(fā)的過程中，還要同步滿足藥監(jiān)部門的法規(guī)要求。青瀾生物和艾棣維欣都是商業(yè)化的企業(yè)，無論面對的項目有多難，雙方在決策啟動項目之前，目標非常明確，就是盡快實現(xiàn)微針藥物遞送的產業(yè)化。

三、青瀾關于微針疫苗的4點思考

    由于青瀾生物和艾棣維欣的相關研究尚未發(fā)表，因此很多數(shù)據(jù)和結果尚不能在此公開。青瀾的微針研發(fā)部分我們只能以點帶面，把一些研究結果與大家分享，過程涉及技術秘密，暫時不深入討論。

     在此我們僅就四個問題點進行討論，但是并不意味著我們需要解決的問題只有這四個方面。

     一、接種時間

     眾所周知，常規(guī)注射疫苗在接種后，需要在留置點觀察30分鐘，如有意外情況便于醫(yī)務人員及時處置。將疫苗接種方式改為可溶解微針貼以后，如果我們要求接種者留置數(shù)個小時，那肯定不能被患者接受，集中接種點也無法容納那么多的接種者。因此，我們必須把接種時間和留置觀察的總時間作為微針疫苗的研發(fā)輸入條件。

     接種時間要與傳統(tǒng)肌注相當，再留置觀察30分鐘。為此聶廣軍課題組的文章中將微針貼設計成了三層結構，中間的分離層能很快地液化從而讓針體部分實現(xiàn)快速斷裂。但是研究者選用的快速分離材料要求的溫度是14-16攝氏度（詳細見論文相應部分），這個要求在疫苗接種實踐中顯然難以實現(xiàn)，這個設計也導致微針成品的質量容易受到溫度的影響。從實驗室研究的角度來看，采用這樣的技術方案無可厚非，能達到最終的研究目的即可。但如果最終目的是需要上市申報的微針疫苗貼，必須采用可靠的工藝和合法合規(guī)的材料來實現(xiàn)，使用任何不被藥典收錄的材料，都將會給藥品申報帶來巨大的法規(guī)方面的困難。

     青瀾生物采用專利技術，完全使用藥典內材料，只需幾秒的貼敷時間，即可實現(xiàn)微針藥物在皮內快速釋放，幾乎是貼上即可移除。具體參見視頻展示。我們能夠看到貼敷之前顯微鏡可見染色針體整齊排列無缺損，貼敷好以后立即揭掉，我們看到揭下來的殘貼上染色針尖都不見了（此處我們以同樣具有角質層的樹葉來代替皮膚）。在顯微鏡下觀察樹葉表面，發(fā)現(xiàn)每個刺入孔內都有染色的藥物。

二、工藝問題

     從圖3可以看到，聶廣軍課題組團隊開發(fā)的微針由三層材料構成，這也就意味著微針的生產過程會使用三種溶液進行制膜，所使用的材料是否滿足法規(guī)要求不談，這樣的工藝會導致生產效率較為低下，藥品質量控制難度大，生產過程中和后續(xù)物流存儲過程藥品質量風險大。 從視頻可以清晰的看到，青瀾生物的微針由兩層構成，分別是染色的針體部分以及無色的基膜部分。青瀾的第一個優(yōu)勢，是能做到在室溫下，貼敷幾秒即可實現(xiàn)藥物針尖的向皮內遞送。第二個優(yōu)勢在于，青瀾微針產品的生產過程只有兩種溶液，分別是針尖液和基膜液，制膜過程只需要兩步。更難能可貴的是，視頻中的樣品并非實驗室制作，而是由青瀾生物的生產線制作完成。青瀾生物一貫堅持，在嘗試某個新工藝前就充分考慮到后續(xù)的可量化生產性，即研發(fā)的產品最終是否能在生產線實現(xiàn)穩(wěn)定、高效的生產。

       我們知道可溶解微針又包含兩種生產工藝，分別是一體針工藝（圖6）和分層針工藝（圖7），前者適用于化藥，后者適用于生物藥。

              （圖6）

（圖7）

        聶廣軍課題組的研究即采用了分層針工藝。在全球微針產業(yè)化領域，能成功大規(guī)模量產一體針工藝的公司可謂寥寥，青瀾生物已經成功具備了分層針的大規(guī)模量產能力。2021年9月23日，艾棣維欣董事長兼首席科學家王賓教授帶領CMC團隊考察青瀾生物生產線（圖8），就工藝的可靠性和產能情況進行了現(xiàn)場考察和確認。我們認為，產品的生產工藝一定要可靠，產能一定要跟上，否則研究做得再漂亮，如果最終不能實現(xiàn)穩(wěn)定量產，那也只有學術價值而無商業(yè)價值。

（圖8）

     鑒于與青瀾生物展開合作的藥企越來越多，2021年10月，青瀾生物在深圳銀星科技園投資建設了專門用于微針藥物研發(fā)的GMP工廠，計劃2021年12月31日之前投入使用。

     在產業(yè)化階段，在實驗室探索微針的工藝已經變得沒有太多價值，因為即使做出結果，無法固化工藝條件，也無法具體知道實驗結果是在什么樣的條件下做出。青瀾生物深圳茜坑工廠不再參與藥物研發(fā)，專注生產化妝品等醫(yī)美類微針產品，從物理硬件上實現(xiàn)化妝品和藥物研發(fā)生產分離。以DNA新冠疫苗產能為例，如果有需求，青瀾生物只需要3000平方的廠房，就可以生產出足夠全球人民接種的疫苗微針貼。

三、法規(guī)問題

       文獻研究中使用了PEI納米顆粒包裹的DNA質粒和非水溶性佐劑，成功地解決了透膜、溶酶體逃逸等的問題，PEI材料也是科學研究中基因藥物遞送常用的轉染劑。然而，目前尚無一款使用PEI作為輔料的藥物產品獲得監(jiān)管部門的批準——PEI的細胞毒性是不可回避的現(xiàn)實風險。但在聶廣軍課題組的研究中，也得到了非常明確的結論：無PEI納米顆粒包裹的裸DNA質粒即使做成了微針，也沒有成功實現(xiàn)細胞轉染，也沒有檢測到有最終的抗原蛋白的表達，也就是說把裸DNA質粒做成微針貼進行貼敷，是沒有免疫源性的，不能激起機體的免疫應答。

      作為一個產業(yè)化企業(yè)，青瀾需要做可商業(yè)化的產品。在面臨法規(guī)監(jiān)管方面的難題和技術難題時，我們選擇了攻克技術難題，而不是挑戰(zhàn)監(jiān)管。使用一個不滿足監(jiān)管要求的材料，可能會導致我們的藥物開發(fā)在數(shù)年內原地踏步。

      艾棣維欣與NASDAQ上市公司INOVIO采用電轉儀作為DNA疫苗克服透膜和溶酶體逃逸的工具，并且商品化了CELLECTRA電轉儀，采用電脈沖的物理方式讓DNA質粒進入細胞核。有了電轉儀，青瀾生物在與艾棣維欣合作開發(fā)過程中，始終堅持遞送裸質粒，不引入不符合法規(guī)的任何材料，并在動物實驗中獲得了較好的抗體滴度。

四、實驗數(shù)據(jù)穩(wěn)定性

    可溶解微針是一種藥物遞送方式，是一種劑型技術。2017年，F(xiàn)DA出了非強制性的微針類產品審評指南，并在2020年做了更新，將可溶解微針技術在審評原則上歸為藥械組合，雖然我們堅持認為可溶解微針本質上是創(chuàng)新劑型，但是對微針這樣顛覆性的技術，F(xiàn)DA出一個審評原則總比審評方式空缺要好，至少讓可溶解微針的研發(fā)和申報有了一個指導原則。歐洲、日本、中國的藥監(jiān)部門應該都會參考這個審評指導原則。

      可溶解微針既然是一種劑型，是藥物的承載和遞送方式，那么可溶解微針產品的相關研究數(shù)據(jù)也應該是與藥品劑型研發(fā)有同等的要求。但目前行業(yè)大多企業(yè)關于可溶解微針的可靠性數(shù)據(jù)研究數(shù)據(jù)不夠穩(wěn)定。部分藥企的某款藥物采用了微針劑型，所得到的研發(fā)數(shù)據(jù)雜亂無章，不要說拿去申報，可能自己內部都無法整理成確定的實驗結果。青瀾生物接觸過的某歐洲藥企，溝通完后認為青瀾生物在微針方面確實談了一些之前未掌握的技術信息，但是不愿意再次啟動微針項目，原因是其與美國某微針企業(yè)之前開展過一次微針藥物的研發(fā)合作，但是得到的研發(fā)數(shù)據(jù)很不穩(wěn)定，不能作為研發(fā)結果沉淀下來，最后不得不終止項目。

     微針藥物研發(fā)的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性平行性，是阻礙微針行業(yè)產業(yè)化的重要因素，如果研發(fā)數(shù)據(jù)雜亂無章，那就說明這個微針技術不是穩(wěn)定可靠的遞送方式，這是藥物這種特殊商品所不能接受的。

      我們反復強調可溶解微針技術是一個結果導向的技術，微針藥物研發(fā)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性也只能靠多批次的實驗結果來證明，而不能通過其他間接方式證明。

     在我們與艾棣維欣合作研究的9個月中，青瀾生物負責微針制劑學開發(fā)、微針生產工藝開發(fā)、微針質量研究等方面的工作，評價方面的所有工作由艾棣維欣完成，青瀾生物協(xié)助貼敷方法培訓。

     在青瀾向艾棣維欣提供的若干批次的樣品，不論每個批次的抗體滴度的絕對值高低，在批次內數(shù)據(jù)平行性都非常好，不論結果好壞，都非常好下清晰的結論。當收到艾棣維欣方面的結果反饋，青瀾生物在調整優(yōu)化變量時，所得到的結果與所調整的變量剛性相關，研究邏輯隨著研究的進展越發(fā)牢固。研究一路走來，逢山開路，逢水搭橋，有一些需要研究的基礎問題，整個文獻領域內都尚無人展開研究，我們都要去研究并找到相應的產業(yè)化解決之道。

       困難道路需要結伴同行。在與艾棣維欣合作2個月時，2021年4月雙方洽談展開戰(zhàn)略合作，由艾棣維欣戰(zhàn)略入股青瀾生物，并于3個月后完成交割。這是雙方在技術、公司文化兩方面的深度互信的結果。

        基因藥物遞送幾乎是所有藥物遞送里最難的，也是最麻煩的。青瀾生物有幸在啟動的第一個藥物項目就是DNA新冠疫苗，在與艾棣維欣合作的9個月里，我們深入的與艾棣維欣的研發(fā)、質量、法規(guī)注冊、CMC等各部門進行了多輪溝通，讓我們深刻的學習了滿足法規(guī)下的技術研發(fā)如何開展。

         今年是青瀾生物的藥物研發(fā)年，下半年陸續(xù)有數(shù)家國內上市藥企與青瀾生物展開合作。目前青瀾生物涉及的微針藥物涵蓋DNA疫苗、滅活疫苗、蛋白、多肽、水溶性化藥、非水溶性化藥等，我們的實驗室冰箱里，存放了很多藥企客戶郵寄過來的各種原料藥。路漫漫其修遠兮，吾將上下而求索。青瀾生物的使命就是實現(xiàn)可溶解微針技術的產業(yè)化。